|
|
Dvousložkový signalizační systém bakterií využívající analogy hemu
Bečková, Alexandra ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
5 Abstrakt Hemoproteiny jsou esenciální součástí jak prokaryontních, tak eukaryotních organizmů, kde hrají roli při naplňování mnoha významných životních funkcí. Dle funkce je možné hemoproteiny rozdělit do několika typů. Konkrétní typ proteinů, který byl i objektem zájmu téhle bakalářské práce jsou senzorové hemoproteiny. Funkce části těchto senzorových hemoproteinů spočívá v schopnosti detekce diatomických molekul plynů a jejich následném navázaní na molekulu hemu v daném hemoproteinu, čímž se změní vlastnosti taky senzorového hemoproteinu a následně se signál stává součástí signalizačních drah. Příkladem senzorového hemoproteinu je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény z Anaeromyxobacter sp. Fw 109 (AfGcHK), s kterou se během experimentální části bakalářské práce pracovalo. Nejprve byla provedena transformace E. coli BL-21 (DE3) buněk plazmidem pET21c(+)/AfGcHK, následná kultivace buněk a exprese AfGcHK proteinu v buňkách. Exprimovaný AfGcHK protein byl izolován ve dvou formách. Jedna forma představovala AfGcHK protein s obsahem hemu, tedy se zabudovaným železem ve své struktuře. Druhá forma představovala AfGcHK protein s obsahem analogu hemu, který měl ve své struktuře místo železa zabudován nikl. Protein s obsahem hemu byl izolován s výtěžkem 3,98 mg/l TB média a protein s obsahem...
|
|
|
Hemové senzorové proteiny jako potenciální markery oxidačního a buněčného stresu indukovaného ionizujícím zářením
Vávra, Jakub ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Souček, Pavel (oponent) ; Tichý, Aleš (oponent)
Ionizující záření je jedním z možných induktorů oxidačního stresu v buňce. Důsledkem této patologické situace je vznik reaktivních radikálů, které mohou modifikovat klíčové biomolekuly. V závislosti na dávce způsobuje expozice organismu ionizujícímu záření deterministické (nemoc z ozáření) či stochastické (maligní procesy) účinky. Proto je v případě suspektní expozice organismu ionizujícímu záření nutno rychle a efektivně stanovit jeho dávku. Přesto nebyla dosud vyvinuta účinná, rychlá a zároveň rutinně aplikovatelná metoda pro stanovení dávky pomocí biologických markerů. Cílem předkládané disertační práce je proto prostřednictvím nových poznatků o hemových senzorových proteinech přispět k pochopení mechanismů, jimiž buňky reagují na oxidační stres. Předkládaná disertační práce se zaměřuje na dva eukaryotické proteiny, kinasu HRI (z anglického názvu "heme regulated inhibitor") a transkripční faktor p53. Důraz je kladen na modulaci funkcí a konformačního stavu těchto proteinů prostřednictvím molekuly hemu. Součástí disertační práce je také optimalizace metod klíčových pro splnění jejích hlavních cílů. Konkrétně byla pomocí elektroforézy v prostředí Phos-tagu studována kinasová aktivita přirozené formy HRI a mutantní formy Gly202Ser, jejíž výskyt je asociován s nádory plic. V případě obou forem byl...
|
|
|
Detailní enzymová charakterizace modelového zástupce hemových kyslíkových senzorů
Vojáčková, Lukrécie Sophie ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Čermáková, Michaela (oponent)
Tato práce je zaměřena na hemové senzorové proteiny detekující kyslík, zejména na fosfodiesterasu z bakterie Escherichia coli, označovanou jako EcDOS. Tento enzym katalyzuje degradaci c-di-GMP, což je důležitá signální molekula bakterií, jež má vliv na určité buněčné pochody, např. na pohyblivost bakterií nebo tvorbu biofilmů. Práce se zabývá detailní enzymovou kinetikou forem proteinu v různých redoxních a ligandových stavech iontu železa hemu [Fe(III), Fe(II) a Fe(II)-O2] a věnuje se také mutantní formě tohoto enzymu (EcDOS H77A), která neváže hem. Jedním z výsledků práce bylo potvrzení toho, že forma EcDOS WT Fe(II)-O2 vykazuje vyšší hodnoty kcat než forma EcDOS s iontem železa hemu v redukovaném stavu. Překvapením bylo zjištění, že aktivita enzymu je ovlivněna nejen stavem iontu železa hemu, ale i přítomnými dvojmocnými kationty kovů a jejich koncentracemi. Přítomnost kationtu kovu je pro funkci enzymu esenciální a vhodnými ionty kovů, které stimulují enzymovou aktivitu, jsou Mg2+ , Mn2+ a Zn2+ nebo jejich směsi, jež působí na aktivitu enzymu za zvolených podmínek synergicky. Analýza pomocí ICP-MS také prokázala, že kationty Zn2+ jsou přirozenou součástí enzymu. Tudíž by pro další kinetické studie bylo vhodné využít Zn2+ nebo směsi iontů kovů, které jsou fyziologické pro E. coli, z níž EcDOS...
|
|
|
Studium struktury a funkce modelových hemových proteinů
Lengálová, Alžběta ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Hudeček, Jiří (oponent) ; Muchová, Lucie (oponent)
Hem je jedním z nejdůležitějších a nejlépe prostudovaných kofaktorů potřebných pro správné fungování mnoha proteinů. Proteiny obsahující hem tvoří obrovskou skupinu biologicky významných molekul, které se účastní mnoha fyziologických procesů. Předkládaná disertační práce se věnuje dvěma skupinám hemových senzorových proteinů, a to prokaryotickým hemovým senzorům plynných molekul a eukaryotickým senzorům detekujících hem. Hemové senzory, které detekují plynné molekuly, hrají důležitou roli v regulaci mnoha bakteriálních procesů a jsou obvykle tvořeny dvěma doménami, doménou senzorovou a doménou funkční. Disertační práce se zaměřuje na studium dvou zástupců ze skupiny bakteriálních senzorů detekujících plyny, histidinkinasy AfGcHK a diguanylátcyklasy YddV. Hlavním cílem práce bylo objasnit mechanismus mezidoménového přenosu signálu u těchto dvou modelových hemových senzorů. Za pomoci rentgenové krystalografie a metody vodík-deuteriové výměny v kombinaci s hmotnostní spektrometrií byly odhaleny významné rozdíly ve struktuře proteinu AfGcHK při přechodu z jeho aktivní na neaktivní formu. Příjem určitého signálu senzorovou doménou AfGcHK ovlivní strukturní vlastnosti proteinu, a tyto konformační změny mají pak nepřímo vliv na enzymovou aktivitu domény funkční. Disertační práce se dále detailněji věnuje...
|
|
|
Studium vlivu analogů hemu na strukturně-funkční charakteristiku modelového zástupce hemových senzorových proteinů
Ďatko, Peter ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Vávra, Jakub (oponent)
Hemové senzorové proteiny umožňují bakteriálním buňkám reagovat na změnu koncentrace látek v jejich okolí. Tato odpověď závisí na vazbě ligandu na atom železa, koordinovaného v molekule hemu. Modelem tohoto signálního systému je histidinkinasa s globinovou strukturou senzorové domény, AfGcHK. Hlavním cílem této bakalářské práce byla příprava a základní charakterizace formy AfGcHK, která místo hemu obsahuje komplex protoporfyrinu s manganem. Pro expresi proteinu byla využita transformace buněk E. coli BL- 21 (DE3) plamidem pET21c(+)/AfGcHK. Protein byl izolován a purifikován pomocí afinitní chromatografie a gelové chromatografie. Pro zjištění enzymové aktivity byla použita elektroforéza na polyakrylamidovém gelu v prostředí dodecylsíranu sodného s přídavkem Phos-tagu. Bylo zjištěno, že připravená unikátní forma AfGcHK je enzymově aktivní. Dále provedená spektrální analýza prokázala, že forma AfGcHK obsahující komplex protoporfyrinu s manganem je citlivá k redukci dithioničitanem sodným. Klíčová slova: hem, hemové senzorové proteiny, kyslíkový senzor, přenos signálu
|
|
|
Biochemická charakterizace modelového zástupce hemových senzorových proteinů obsahujícího analog hemu
Hlubučková, Darina ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Prošková, Veronika (oponent)
Nedílnou součástí života buněk je buněčná signalizace, která je zajištěna mimo jiné hemovými proteiny, konkrétně jejich skupinou s názvem hemové senzorové proteiny. Hemové senzorové proteiny se dělí do dvou skupin, hemové senzorové proteiny detekující hem, které se vyskytují spíše v eukaryotních buňkách a hemové senzorové proteiny detekující plynné molekuly, které jsou typické spíše pro prokaryotní buňky. Plynnými molekulami mohou být v tomto případě CO, NO a O2. Skupina hemových senzorových proteinů detekujících kyslík má kruciální význam pro bakterie, které se musí přizpůsobovat proměnlivé koncentraci kyslíku v okolním prostředí. Jednou z těchto bakterií je půdní bakterie Anaeromyxobacter sp., kmen Fw 109-5, která obsahuje hemový senzorový protein s globinovou strukturou senzorové domény a histidinkinasovou aktivitou domény funkční (AfGcHK), umožňující bakteriím kromě jiného například tvorbu biofilmu.. . V rámci teoretické části této práce byly shrnuty dosavadní poznatky o hemových senzorových proteinech se zaměřením na protein AfGcHK. V praktické části této bakalářské práce byly transformovány bakteriální buňky E. coli BL-21 (DE3) plazmidem pET21(+)/AfGcHK obsahujícím gen kódující AfGcHK, ze kterých byly následně izolovány dvě formy AfGcHK, přirozená forma a forma obsahující analog hemu,...
|
|
|
Sekvenování genu ALAS2
HOLOUBKOVÁ, Renata
Ve své bakalářské práci jsem se zabývala detekcí mutací v genu ALAS2. V teoretické části jsem se zabývala seznámením se s genetickými pojmy a samotným oborem genetika. Práce začíná od samotné buňky, po chromozomy, přes mutace. Dále jsem se zabývala přímo genem ALAS2. V následujících kapitolách jsem se zaměřila na hem, neboť gen ALAS2 kóduje enzym, který je zodpovědný za produkci hemu. V neposlední řadě jsem popsala onemocnění erytropoetickou protoporfyrii a sideroblastickou anémii, která vznikají právě kvůli mutacím v tomto genu. V praktické části jsem se věnovala vyšetření genu ALAS2 exonu 11. Vyšetřovala jsem 25 zanonymizovaných vzorků, ze kterých jsem izolovala DNA. Požadovaný úsek genu jsem poté metodou PCR naamplifikovala. Vzorky jsem připravila na metodu sekvenování, která proběhla u firmy GenSeq s.r.o. V poslední části mé bakalářské práce jsem se zabývala jednak hodnocením sekvencí a zpracováním výsledků, ale také vyhodnocením sekvencí od dětí z Karvinska a Českobudějovicka, které jsem obdržela. Z celého vyšetřovaného souboru a souboru na zhodnocení nebyly nalezeny žádné mutace. Pro hodnocení z většího souboru dat byly přidány výsledky nalezených mutací z výzkumu.
|
|
|
Light-harvesting like domain of the cyanobacterial ferrochelatase
PAZDERNÍK, Marek
This thesis is focused on elucidating the function of the C-terminal transmembrane lightharvesting complex like (LHC) domain of the cyanobacterial ferrochelatase (FeCh). Using the model cyanobacterium Synechocystis PCC 6803, I show that the FeCh LHC domain can bind chlorophyll (Chl) and carotenoids; however, this pigment binding occurs only when the biosynthesis of heme and Chl in the cell is misbalanced. Further, I found that point mutation, which prevents the pigment binding to FeCh LHC domain results in a misregulated ratio between heme and Chl during stress conditions due to low heme accumulation. My data also show that the FeCh LHC domain interacts with CurT protein most likely to localize the FeCh into a specialized membrane domain, where the synthesis of photosystem II is proposed to occur. Based on my data I propose that the role of the FeCh LHC domain is to monitor the availability of Chl during photosystem biogenesis and to coordinate Chl availability with the synthesis of heme.
|
|
|
Specific heme interaction modulates the conformational dynamics and function of p53
Sergunin, Artur ; Martínková, Markéta (vedoucí práce) ; Dračínská, Helena (oponent)
Tumor supresor p53 je jedním z nejvíce studovaných proteinů v souvislosti s rakovinou a mechanismem jejího vzniku. Obecná funkce p53 spočívá v transkripční regulaci celé řady genů, které různými způsoby ovlivňují velké množství buněčných procesů. Nedávné studie odhalily vztah mezi p53 a homeostázou železa v buňce. Konkrétně, bylo ukázáno, že p53 je schopen interagovat s molekulou hemu a tato interakce vede ve výsledku k narušení DNA- vazebných schopností p53 a podporuje jeho proteazomální degradaci. Tato práce se zabývá podrobným popisem vazby molekuly hemu na p53. Za tímto účelem jsme izolovali dvě formy proteinu p53, bez hemu a s navázaným hemem. Zjistili jsme, že se liší konformační dynamika obou forem s tím, že forma s hemem vykazuje vyšší stupeň flexibility. Taktéž jsme potvrdili dřívější práce, že hem reaguje s p53 specificky a této interakce se účastní cysteinový zbytek. Nicméně, bylo zjištěno, že vazba hemu žádným způsobem nenarušuje oligomerní stav p53 a ani jeho přirozenou schopnost vázat zinek. Nakonec jsme ukázali, že p53 s navázaným hemem má značně narušené DNA-vazebné schopnosti v porovnání s p53 bez hemu. Klíčová slova: hem, senzorové proteiny, protein p53, transkripční faktor, vnitřně neu- spořádané proteiny
|
|
|
Role iontů železa v metabolismu améby Naegleria gruberi
Ženíšková, Kateřina ; Konvalinka, Jan (vedoucí práce) ; Hlouchová, Klára (oponent)
Železo je biogenní stopový prvek, jehož dostupnost je pro organismy životně důležitá. V biologických systémech se vyskytuje železo ve formě iontů Fe2+ a Fe3+ , které jsou většinou inkorporovány do struktury hemu nebo železo-sirných center. Proteiny obsahující železo mají v organismu širokou škálu působnosti, od přenosu elektronů v dýchacím řetězci (Rieskeho proteiny, cytochromy), přes podílení se na syntéze DNA (ribonukleotidreduktasy), až po účast v Krebsově cyklu (akonitasa a sukcinátdehydrogenasa). Naegleria gruberi je volně žijící améba, známá pro svou příbuznost s patogenní amébou Naegleria fowleri, způsobující primární améboidní meningoencefalitidu. Zajímavé je, že v jejím genomu jsou obsaženy geny pro aerobní i anaerobní metabolismus. V rámci této bakalářské práce byl zkoumán vliv dostupnosti iontů železa na metabolismus buněk Naegleria gruberi. Byly studovány změny aktivit enzymů vyskytujících se v různých metabolických drahách, a to u alkoholdehydrogenasy, glukokinasy, laktátdehydrogenasy, izocitrátdehydrogenasy, Fe-hydrogenasy, akonitasy a fumarasy. V závislosti na dostupnosti iontů železa byly zaznamenány největší změny u aktivit alkoholdehydrogenasy a hydrogenasy. Klíčová slova: železo, hem, železo-sirná centra, dostupnost iontů železa, Naegleria gruberi, metabolismus
|
host ::
RSS.